<delect id="xlj05"><acronym id="xlj05"></acronym></delect> <delect id="xlj05"><acronym id="xlj05"></acronym></delect> 大規(guī)模生產階段，AAV/LV載體生產流程跟抗體、疫苗類藥物的生產類似，主要包含上游培養(yǎng)、下游純化及制劑部分。上游培養(yǎng)分為質粒開發(fā)、細胞擴增、三質粒共轉染及病毒載體生產等步驟。下游純化分為細胞裂解釋放AAV病毒顆粒（可以通過去污劑、機械作用、高滲或凍融操作等）or收獲細胞上清液得到含LV病毒原液、加入核酸酶以減少宿主細胞核酸污染、澄清是通過離心或過濾等方法去除細胞碎片和雜質等、超濾濃縮以減少后續(xù)色譜純化體系、親合及離子交換等純化得到高純度病毒載體。制劑部分主要是超濾更換緩沖液、過濾除菌及制劑灌裝等。SAN HQ高鹽核酸酶具有熱不穩(wěn)定的特性，在還原劑存在條件下，50℃、30min孵育即可失活；浙江ArcticZymes高鹽核酸酶70921-160
一般來說，生物生產工藝用的核酸酶以BenzonaseTM（BenzonaseTM是Merck的注冊商標）為主，能高效降解任何形式（雙鏈、單鏈、線狀、環(huán)狀）的DNA和RNA。該酶來自于大自然界普遍存在的S.Marcescen，通過E.coli發(fā)酵生產得到。該酶的適宜反應條件是低鹽濃度范圍（<100mM鹽濃度），且酶活隨著鹽濃度上升而下降，在300mM鹽濃度時酶活幾乎喪失。對于細胞基因藥物常用的兩種病毒載體LV和AAV，LV由于含有脂包膜結構一般都在生理鹽條件下存在，而AAV在高鹽條件下不易團聚、更穩(wěn)定。而在生理鹽濃度及更高濃度條件下，Benzonase活性受到抑制。天津高鹽核酸酶70921-202鑒于其在高鹽條件下的較高活性，SAN HQ高鹽核酸酶在不損失載體產量和活性的情況下改善了下游工藝。
氯化銫(CsCl)/碘克沙醇密度梯度離心大概是經典的AAV純化技術了。這種技術適用于所有血清型且分辨率高，但是因生產工藝很難放大，低通量等缺點阻礙了其在工業(yè)中的應用。繼密度梯度離心之后，色譜法不斷發(fā)展，并逐漸成為一種成熟的、主流的方法。色譜法通過載體的凈電荷、疏水性、對配體的親和性、大小以及其他性質來分離并純化載體。這類技術有諸多的優(yōu)點：更具可擴展性和成本效益，可多次重復使用，可并行運行或串聯(lián)運行，還可有效去除非定植劑，這是開發(fā)后期的一個關鍵方面。
染色質由組蛋白和DNA組成，——147個堿基對的DNA纏繞在8個組蛋白（由H2A、H2B、H3和H4形成的八聚體）周圍，形成基本的染色質單位，即核小體。核小體像珠串一樣串連在一起，并被包裝成更高階的染色質結構。DNA帶負電荷，富含堿性氨基酸的組蛋白帶正電荷，且組蛋白多聚物有很多疏水區(qū)段。所有這些特點導致宿主DNA殘留（HCD）能吸附很多物質，包括宿主蛋白殘留（HCD）、色譜填料、目的病毒顆粒等，因此，HCD的存在增加了工藝流程的復雜度，同時也降低了病毒顆粒的穩(wěn)定性。SAN HQ高鹽核酸酶在鹽濃度400-650mM條件下活性達到峰值。
在生物工藝中，核酸酶的主要作用是高效消化宿主細胞DNA（HCD），并將其分解成足夠小的片段，以便在下游純化過程中去除。雖然大多數(shù)核酸酶可以在生理鹽條件下高效地將裸DNA降解成微小片段，比如Benzonase和SANs都可以把dsDNA分解成小于8nt的寡核苷酸鏈，但實際生產中的核酸污染情況更加復雜。HCD通常以染色質形式存在，與細胞裂解碎片、病毒顆粒等結合在一起，影響核酸酶的識別及剪切。因此，HCD去除的關鍵在于——核酸酶如何在復雜的生產體系中識別并剪切HCD。在AAV生產過程中使用SAN HQ高鹽核酸酶。河南500mM鹽濃度條件高鹽核酸酶70921
高鹽濃度下，宿主DNA與蛋白質能夠更高效解離，從而更容易被降解。浙江ArcticZymes高鹽核酸酶70921-160
?通過三質粒瞬轉體系生產病毒載體，會引入宿主細胞DNA殘留（HCD）、蛋白殘留（HCP）、工藝雜質（如antibiotics、核酸酶等外源物質）等污染，存在潛在的致瘤性和免疫原性等風險。藥品監(jiān)管機構一般允許生物制品中存在10ng/dose以下的殘留DNA。此外，根據雜質來源、工藝以及產品類型不同，也會對HCD限度做不同要求。為了達到這個要求，一般通過核酸酶處理和色譜聯(lián)用的方法。一般在細胞培養(yǎng)液裂解/收獲、澄清收獲及超濾濃縮等環(huán)節(jié)加入核酸酶處理，需要工藝摸索來確認處理方式。浙江ArcticZymes高鹽核酸酶70921-160
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