武漢細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷

細胞轉(zhuǎn)染的注意事項：1.細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細胞有毒害作用，細胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比，在BHK-21中其活性較高。這三種細菌啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)。武漢細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷

瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測：基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率?？梢允褂脠蟾婊騺泶_定優(yōu)化條件，其表達蛋白易檢測，在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）?？梢允褂煤唵蔚姆峭凰胤椒z測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMVSPORT-bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。上海正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑報價瞬時轉(zhuǎn)染的細胞中，外源基因得以表達但它們并不會整合到細胞的基因組中。

細胞轉(zhuǎn)染常用步驟：1.轉(zhuǎn)染試劑的準備①將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。5.加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。6.到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時~

細胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清：不同的細胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同的。較好是在靠前次實驗前做一個預(yù)實驗，比如：HeLa，293，CHO，COS7，MCF－7，HepG2等細胞，是否加血清，對不同的細胞是有不同的影響的，有些細胞是可以有血清的，有些加血清就會受影響。轉(zhuǎn)染后在6小時左右較好換液且換為有血清的培養(yǎng)基，其一因為普通轉(zhuǎn)染試劑對細胞的毒性作用大，其二可降低因血清的缺乏引起的細胞的死亡。轉(zhuǎn)染時不加血清是防止血清的干擾作用，轉(zhuǎn)染后可適時加入。加入過早會引起未轉(zhuǎn)染細胞的優(yōu)勢生長，過晚會引起較多細胞死亡?？蓪崟r觀察1/5細胞變圓的時候加入血清。選擇傳代次數(shù)較低并處于對數(shù)生長期的細胞進行轉(zhuǎn)染。

DNA細胞轉(zhuǎn)染步驟：1.提前現(xiàn)在細胞鋪板提前現(xiàn)在將細胞種植在24孔板中，以轉(zhuǎn)染時細胞密度在60％左右為宜。2.轉(zhuǎn)染過程⑴將0.8μg的DNA用25μl無血清稀釋液稀釋，充分混勻，制成DNA稀釋液。注意：無血清稀釋液建議采用OPTI-MEM、無血清DMEM或1640。⑵將2μlEntransterTM-H4000用25μl無血清稀釋液體稀釋，充分混勻，制成EntransterTM-H4000稀釋液。室溫靜置5分鐘。⑶將EntransterTM-H4000稀釋液分別加入到DNA稀釋液中，充分混勻（可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上），室溫靜置15分鐘。轉(zhuǎn)染復合物制備完成。⑷將轉(zhuǎn)染復合物加入到含細胞和完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器上，輕柔混勻。注意：①對本試劑，采用含血清的全培養(yǎng)基有助于提升轉(zhuǎn)染效率。其它物理和化學介導的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點。蘇州細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。武漢細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷

細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.試劑過期有時候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況。毛博當年做轉(zhuǎn)染整整半年，百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn)，原來是Lipofectamine2000過期了。換了之后，立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗，盡量使用開封半年內(nèi)的，因為過了半年后，就算沒有過失效期，但是細胞毒性較大增加，而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢，影響實驗進度哈。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時加入血清，會導致細胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候，較好不要換液，不要打擾細胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清武漢細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷