湖北高活性/無(wú)非特異酶活PNGaseF去糖基化酶

Genovis的GlycOCATCH?是一種親和樹脂，可特異性結(jié)合O-糖基化（粘蛋白型）蛋白和肽，從而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單的工作流程，以富集和純化攜帶O-聚糖的蛋白質(zhì)和肽。洗滌離心柱，并用8M尿素洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。對(duì)洗脫材料的分析表明，由于洗脫O-糖基化蛋白，并且樹脂與非糖基化蛋白和N-糖基化蛋白的結(jié)合可以忽略不計(jì)。選擇性結(jié)合 O-糖蛋白：為了測(cè)試選擇性，將一系列 O-糖基化、N-糖基化和非糖基化蛋白與Genovis的GlycOCATCH 一起孵育。為了在肽水平上研究Genvois的GlycOCATCH的O-糖特異性，將O-glcyosyled肽（糖蛋白）與一系列未修飾的肽混合。FucosEXO 可在 1 至 2 小時(shí)內(nèi)水解糖蛋白上的末端 α1-2,3,4 。湖北高活性/無(wú)非特異酶活PNGaseF去糖基化酶

Genovis的PNGase F（肽 N-糖苷酶 F）是一種糖酰胺酶，可水解多肽天冬酰胺與所有哺乳動(dòng)物天冬酰胺連接復(fù)合物、雜交或高甘露糖寡糖的內(nèi)層 GlcNAc 之間的酰胺鍵。該酶用于MS分析前的樣品制備，以降低蛋白質(zhì)異質(zhì)性并實(shí)現(xiàn)游離的聚糖分析，并研究N-聚糖的功能作用。1. 對(duì)所有哺乳動(dòng)物N-聚糖的高效水解；2.對(duì)多種糖蛋白具有活性；3.可固定在即用型離心柱產(chǎn)品形式；4. 自動(dòng)化友好型，96孔板，用于高通量 N-糖去除。Genovis的ImpaRATOR 是一種 O-糖依賴性蛋白酶，可消化攜帶粘蛋白型。O-聚糖的蛋白質(zhì)，包括唾液酸化物質(zhì)、糖基化絲氨酸和 Thr 殘基的 N-末端。該酶產(chǎn)生攜帶 O-糖的糖肽，從而實(shí)現(xiàn) O-糖譜分析、位點(diǎn)占用測(cè)定和 O-糖肽圖譜以及使用 LC-MS 分析的中級(jí)方法。1. 特異性廣 - 接受多種 O-聚糖變體，包括唾液酸化物種；2. 可靠O-聚糖特異性蛋白酶 – 消化絲氨酸/蘇氨酸糖基化位點(diǎn)的 N 末端；3. 穩(wěn)健的消化，增強(qiáng)復(fù)雜生物制藥的表征。河北N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶生物藥物開(kāi)發(fā)可以用8M尿素進(jìn)行洗脫；或使用活性O(shè)peRATOR酶進(jìn)行洗脫。

SialEXO 2-3 在天然條件下水解糖蛋白，在 pH 值范圍為 7.0 至 9.0 時(shí)顯示出活性。該酶來(lái)源于Akkermansia muciniphila，并在大腸桿菌中表達(dá)。該酶具有 His 標(biāo)簽，分子量為 66 kDa。1. 用于方法開(kāi)發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高用于離心柱中糖蛋白去唾液酸化的固定化酶。Genovis的SialEXO固定化離心柱含有與瓊脂糖珠共價(jià)偶聯(lián)的SialEXO酶，用于糖蛋白的去唾液酸化，而不會(huì)被酶污染z終制劑。它水解天然糖蛋白上的唾液酸（α2-3、α2-6 和 α2-8）并釋放出聚糖。效率；3. 適用于自動(dòng)化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可。

與PNGase F類似，Genvois的OmniGLYZOR 含有固定化酶的混合物，可快速有效地去除抗體、融合蛋白和其他糖基化蛋白上的 N 和簡(jiǎn)單的粘蛋白型 O-聚糖。聚糖的去除被用于減少異質(zhì)性，以促進(jìn)蛋白質(zhì)的分析，例如質(zhì)譜法。去糖基化也可用于研究聚糖的功能作用。N-和粘蛋白型O-連接聚糖的快速高效去糖基化；即用型離心柱形式 - 無(wú)酶干擾分析；與LC-MS兼容。與PNGase F類似，Genvois的與PNGase F類似，Genvois的OmniGLYZOR 含有去除 N-糖和最常見(jiàn)的粘蛋白型 O-糖所需的酶，即單唾液酸和二唾液酸he心 1 和 Tn 抗原 （α-GalNAc）。OmniGLYZOR Microspin 小柱中包含以下組分：PNGase?F；O-糖苷酶。在大腸桿菌中表達(dá)，帶有His標(biāo)簽，分子量為52 kDa。

對(duì)Genovis的ImpaRATOR處理的樣品的分析表明，ImpaRATOR很好地消化了所有三種底物并產(chǎn)生了相似的糖肽，但預(yù)期的聚糖種類不同。用ImpaRATOR處理的樣品比其他樣品含有更多的變異，因?yàn)槊糠N肽都檢測(cè)到多種聚糖結(jié)構(gòu)。觀察到的聚糖種類主要是單唾液酸化和二唾液酸化he心1結(jié)構(gòu)，這與依那西普的預(yù)期一致。用ImpaRATOR或OpeRATOR消化的SialEXO預(yù)處理樣品均產(chǎn)生具有裸核1結(jié)構(gòu)的肽，但攜帶在ImpaRATOR消化樣品中觀察到的Tn抗原的肽T205-P207除外。依那西普用 SialEXO 和 GalactEXO 預(yù)處理，然后用 ImpaRATOR 消化，得到含有 Tn 抗原的肽。總之，這些數(shù)據(jù)證明了ImpaRATOR的高聚糖底物接受度。ImpaRATOR處理的依那西普顯示出與相應(yīng)的去唾液酸化OpeRATOR處理樣品略有不同的消化模式。例如，OpeRATOR在兩個(gè)O-糖基化氨基酸之間消化的效率比ImpaRATOR更有效。具有完整唾液酸或Tn抗原的依那西普被OpeRATOR消化得非常弱（數(shù)據(jù)未顯示）。將OglyZOR酶與依那西普、TNFR 和阿巴西普在 37°C 下有或沒(méi)有 SialEXO 孵育 1 小時(shí)。陜西凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

GalactEXO微離心柱經(jīng)過(guò)格式化，可在30-60分鐘內(nèi)水解0.5mg糖蛋白中的半乳糖。湖北高活性/無(wú)非特異酶活PNGaseF去糖基化酶

蛋白質(zhì)的N-糖基化特征是一個(gè)關(guān)鍵的質(zhì)量屬性。它會(huì)影響生物制藥的安全性和有效性，因此需要在開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行表征和監(jiān)測(cè)。常見(jiàn)的聚糖分析工作流程是用PNGase F釋放N-聚糖，然后用熒光標(biāo)記物（如2-AB、2-AA、普魯卡因胺或RapiFluor-MS?（沃特世公司））標(biāo)記生成的聚糖。然后使用HILIC-HPLC或毛細(xì)管電泳分離標(biāo)記的聚糖，以表征和定量不同的聚糖結(jié)構(gòu)。 在這里，使用游離聚糖方法分析zhiliao性抗體曲妥珠單抗、Fc-融合蛋白依那西普和糖蛋白R(shí)Nase B的N-聚糖。曲妥珠單抗和依那西普在天然條件下在37°C下用Genvois的PNGase F去糖基化1小時(shí)，而RNase B需要變性和還原才能完全去糖基化。因此，在50°C下用PNGase F去糖基化10分鐘之前，用RapiGest? SF表面活性劑（沃特世公司）和TCEP處理RNase B。 用RapiFluor-MS標(biāo)記所得游離的聚糖，并通過(guò)HILIC UPLC-FLD-MS進(jìn)行分析。湖北高活性/無(wú)非特異酶活PNGaseF去糖基化酶