山西IgGZEROIdeS蛋白酶蛋白組學

大多數(shù)zhiliao性抗體都攜帶人IgG1骨架，雙特異性和多特異性形式的開發(fā)正在迅速增加。此類抗體的分析需要特異性酶來表征特性，例如單價結合、二硫鍵擾亂和配對Fc糖基化。傳統(tǒng)方案包括使用木瓜蛋白酶和Lys-C的酶消化，這需要優(yōu)化以極大限度地減少過度消化并獲得足夠的產(chǎn)量。Genovis的FabDELLO與IdeS酶具有不同的特異性，它在鉸鏈上方的單個位點消化人IgG1，并產(chǎn)生完整的Fab和Fc片段。為了證明FabDELLO的特異性活性，通過非還原SDS-PAGE消化和分析了IgG1和Fc融合蛋白的選擇。所有底物均實現(xiàn)了完全消化，包括具有其他困難的LALA和LFLE突變的IgG1。FabDELLO酶在底物上的精確和有效性能驗證了其在生物制藥開發(fā)中的用途。含有富含甘氨酸的連接子的各種mAb片段進行詳細表征的中級方法。山西IgGZEROIdeS蛋白酶蛋白組學

IgA 消化酶的 IgASAP 家族特異性消化血清和分泌型人 IgA 以生成 Fab 和 Fc 片段。IgASAP Sub1 特異性消化人 IgA1，而 IgASAP Sub1+2 同時消化人 IgA1 和 IgA2m1。 Sub1+2 特異性消化鉸鏈上方的 IgA1 和 IgA2m1。兩種酶都產(chǎn)生完整且均質的 Fab 和 Fc 片段。為了獲得純和完整的Fab片段，使用Genovis的GingisKHAN Fab Kit進行人IgG1的消化和抗體片段的后續(xù)純化。通過與 GingisKHAN 孵育，然后在 CaptureSelect? 人 CH1 離心柱上親和純化，在曲妥珠單抗上證明了完整的片段生成。樣品的酶和Fc部分存在于色譜柱的流通中，F(xiàn)ab很容易通過降低pH洗脫。使用該試劑盒，可以制備 0.5 mg 至 2 mg 人 IgG1 的 Fab 片段。Genovis同時提供IdeS酶的純化試劑盒。山西FabDELLOIdeS蛋白酶可消化精氨酸殘基的 C 末端蛋白質，包括難以與其他酶消化的 Arg-Pro 鍵。

大多數(shù)商業(yè)zhiliao性抗體屬于IgG類，在Fc結構域中含有N-聚糖。一個重要的關鍵質量屬性是糖基化曲線，因為它會影響穩(wěn)定性、溶解度、藥效學和藥代動力學特性。這種翻譯后修飾可能發(fā)生在生物工藝開發(fā)和制造過程中，因此需要密切監(jiān)測。Genovis的FabRICATOR（IdeS）酶已成為一種被接受的快速表征單克隆抗體（mAb）的分析工具。FabRICATOR在鉸鏈下方消化IgG，產(chǎn)生F（ab'）2和Fc/2片段。單個FabRICATOR消解位點和質量譜的后續(xù)精度使Fc糖基化譜能夠檢測，從而可以監(jiān)測批次間的一致性和其他關鍵質量屬性。

Blinatumomab（一種對 CD19 和 T 細胞標志物 CD3 具有特異性的 BiTE 分子）的研究級生物仿制藥在室溫下用固定化過夜的 Genovis的GlySERIAS 消化。通過LC-MS對消解樣品的直接分析表明，所有三個連接子區(qū)域均被消解，α-CD3 VL和VH鏈洗脫為一個色譜峰，α-CD19 VH和VL鏈作為單獨的峰洗脫。來自連接的 α-CD3 VH 和 α-CD19 VH 結構域的小峰顯示該短連接子未完全消化，表明 GlySERIAS 對短連接子的活性較低。與完整的蛋白質分析相比，四個結構域的分離提供了具有單同位素分辨率的高質量光譜?？梢杂^察到每個結構域的幾個不同變體，剩余的連接子殘基數(shù)量不同。在色譜分離過程中，α-CD3 VH結構域無法從α-CD19 VH結構域完全基線分離，導致在相關質譜中觀察到一些共洗脫。四個結構域的分離產(chǎn)生了有關在完整蛋白質水平上鑒定的蛋白質修飾位置的信息。例如，在完整水平上鑒定的 37 Da 的蛋白質修飾被分配給 α-CD3 VH 鏈。此外，240Da 和 320da 的兩個修飾分別被分配給 α-CD3 VL 結構域。后者還含有一個帶有五六個組氨酸殘基的 His 標簽。這些數(shù)據(jù)證明了使用 Genovis的GlySERIAS Immobilized 對包含多個柔性連接子蛋白進行質量控制的中級工作流程的強大功能。FabRICATOR（IdeS）固定在磁珠上，可同時快速自動消化多種抗體，促進中級表征工作流程。

與IdeS不同，融合蛋白是通過將兩種或多種蛋白質或肽的功能組合成一個量身定制的分子來創(chuàng)造的，以專門應對挑戰(zhàn)。連接此類蛋白質或肽結構域的常見方法是包含柔性連接子。這些連接子通常富含甘氨酸，例如甘氨酸殘基（G），或甘氨酸殘基散布絲氨酸殘基（GS）以形成重復序列。這為連接子提供了足夠的靈活性，不會干擾連接蛋白質結構域的功能。然而，這些新模式帶來了新的分析挑戰(zhàn)，需要新的工具來促進表征和產(chǎn)品質量監(jiān)測。中級分析已成為分析單克隆抗體療法的標準方法，涉及將分子消化成幾個定義的亞基。它們足夠小，可以獲得高質量的質譜圖，并為產(chǎn)品質量屬性提供特定領域的信息。由于G和GS連接子對常見蛋白酶的降解具有抗性，因此很難分離結構域以進行深入分析。因此，Genovis開發(fā)了GlySERIAS，不同于IdeS酶，一種消化柔性富含甘氨酸的連接子的酶。GlySERIAS可以分離不同的功能域，并實現(xiàn)對融合蛋白、多特異性抗體和含有富含甘氨酸的連接子的各種mAb片段進行詳細表征的中級方法。使用GlySERIAS固定化消化融合蛋白得到均質Fc/2。山西FabDELLOIdeS蛋白酶

使用 Genovis的GlySERIAS Immobilized 對包含多個柔性連接子蛋白進行質量控制的中級分析方法具有強大的功能。山西IgGZEROIdeS蛋白酶蛋白組學

Genovis的FabRICATOR是一種半胱氨酸蛋白酶，它對許多不同的物種和IgG亞類都有活性，包括人IgG亞類1-4以及猴子、兔子、大鼠和綿羊IgG的一些亞類。FabRICATOR在鉸鏈下方的單個位點進行消化，生成F(ab’)2和Fc/2子基，可以進一步還原生成Fd’，輕鏈和F/2子基是必需的。FabRICATOR（IdeS）通過蛋白-蛋白相互作用與目標抗體工作，這說明了它的高特異性。事實上，它在單個位點消化意味著使用FabRICATOR時沒有過度消化的風險，其高特異性也意味著相同的消化方案可以作為平臺方法應用于許多不同的抗體。FabRICATOR（IdeS）不需要還原條件來獲得良好活性，也不需要任何額外的輔助因子，它將在不同生理緩沖中發(fā)揮作用。這意味著按照下面的鉸鏈消解，您將生成F(ab’)2和Fc/2片段用于分析或其他應用。山西IgGZEROIdeS蛋白酶蛋白組學