青海FabRICATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

抗體 Fc 糖基化譜是一種重要的 CQA，因為它會影響療效、和免疫原性。因此，需要從早期開發(fā)、工藝開發(fā)到質(zhì)量控制和批量放行的整個過程對Fc聚糖譜進(jìn)行監(jiān)測。傳統(tǒng)的分析方法基于對游離的聚糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后通過HILIC-HPLC或CE進(jìn)行分析，這需要多步驟的樣品制備方案，這需要大量的時間和資源。使用Genovis的FabRICATOR MagIC酶解mAb，然后使用LC-MS進(jìn)行中級分析，為Fc聚糖分析提供了一種快速、直接的替代方法。如上所示，它很容易實現(xiàn)自動化，以提高通量并降低處理錯誤的風(fēng)險。使用胰島素氧化β鏈來比較GingisREX和ArgC的酶特異性。青海FabRICATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，IgA在自身免疫性疾病、過敏反應(yīng)、胃腸道疾病等許多不同的健康狀況中發(fā)揮作用。在天然條件和復(fù)雜生物樣品中選擇性和特異性消化IgA的能力在臨床醫(yī)學(xué)和研究中具有重要價值。IgASAP酶是降低zhiliao性IgA候選物樣品復(fù)雜性并簡化IgA分析表征的寶貴工具。人IgA1和IgA2之間的一個顯著結(jié)構(gòu)差異是鉸鏈區(qū)域。與IgA2相比，IgA1具有更長的富含O-聚糖且更靈活的鉸鏈區(qū)域。IgASAPSub1的消化位點位于該擴(kuò)展區(qū)域，使酶具有IgA1特異性。IgA2亞類以三種等位基因形式存在，A2m1、A2m2和A2m3。IgASAPSub1+2在脯氨酸（P）和纈氨酸（V）之間消化IgA1和IgA2m1只有N端到鉸鏈區(qū)域，但由于A2m2和A2m3中的脯氨酸殘基被精氨酸（R）殘基取代，因此這兩種同種異體型的IgA2對消化具有抗性。青海FabRICATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)用FabDELLO消化市售的IgG1 risankizumab(在下鉸鏈區(qū)域具有LALA突變)。

蛋白酶用于生成肽，用于質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)。這些應(yīng)用包括蛋白質(zhì)組學(xué)和生物制藥的深度表征。由于遺漏了切割和樣品制備誘導(dǎo)的偽影，傳統(tǒng)的蛋白酶并不總是理想的，因此需要具有不同特異性的蛋白酶工具箱。Genovis的GingisREX 是一種精氨酸特異性蛋白酶，可將蛋白質(zhì) C 末端消化為精氨酸殘基。與胰蛋白酶肽相比，所得肽更長，并可能導(dǎo)致序列覆蓋率增加。質(zhì)譜分析中蛋白酶的特異性對于獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集和避免復(fù)雜的數(shù)據(jù)解釋至關(guān)重要。作為模型底物，使用胰島素氧化β鏈來比較 GingisREX 和 ArgC 的酶特異性。胰島素氧化β鏈含有一個精氨酸和一個賴氨酸殘基。在RP-HPLC和質(zhì)譜法上分析GingisREX和ArgC的酶切肽。GingisREX在賴氨酸殘基上沒有酶活性或其他額外活性，即使在長時間孵育過夜后，酶與底物的比例也很高（1：5）。然而，ArgC在精氨酸殘基上顯示出主要活性，但在賴氨酸殘基上也可以看到酶消化。在酶與底物的比例為 1：20 和過夜孵育下，證明了 ArgC 的額外非特異性活性。在相同條件下，GingisREX未檢測到這種情況。數(shù)據(jù)證實了GingisREX精氨酸殘基的特異性活性，并顯示使用Arg-C在賴氨酸和其他殘基處的非特異性消化。

與IdeS不同，Genovis的IgASAP是IgA消化酶家族。IgASAPSub1是一種IgA1特異性酶，可在鉸鏈上方的一個特定位點消化人IgA1，而IgASAPSub1+2特異性消化鉸鏈上方的IgA1和IgA2m1。兩種酶都產(chǎn)生完整且均質(zhì)的Fab和Fc片段。IgASAP酶能夠生成完整的單價Fab片段以及IgA的中級分析，從而促進(jìn)IgA的表征，例如，在疫苗、zhiliao和診斷的開發(fā)過程中。獨特的酶促工具，可實現(xiàn)IgA的中級表征和質(zhì)量控制；生成均相的Fab和Fc片段，并保留免疫反應(yīng)性；高度特異性–人IgA鉸鏈上方的一個消化位點。使用GlySERIAS固定化酶和內(nèi)切糖苷酶GlycINATOR消化度拉糖肽。

與IdeS不同，度拉糖肽由兩個胰高xue糖素樣肽-1 （GLP-1） 分子組成，它們通過柔性 GS 接頭連接到人 IgG4 的 Fc 區(qū)域。為了分別研究肽和 Fc 區(qū)域，從而鑒定結(jié)構(gòu)域特異性 PTM，用 Genovis的GlySERIAS 在 37°C 下凍干消化度拉糖肽 1 小時。為了降低樣品復(fù)雜性，使用內(nèi)切糖苷酶GlycINATOR Lyophilized去除Fc聚糖，并用DTT還原鏈間二硫鍵。反相LC-MS對樣品的分析表明，使用GlySERIAS進(jìn)行連接子消化后，肽從Fc區(qū)域完全去除。連接子中的大量甘氨酸殘基為GlySERIAS提供了許多不同的潛在消化位點，這就是為什么Fc/2和GLP-1肽都被檢測為幾種變體，其中不同數(shù)量的甘氨酸和絲氨酸殘基仍然連接。此外，還鑒定了GLP-1肽的氧化。盡管GlySERIAS同時在多個位點進(jìn)行消化，但一式三份的酶解在獲得的不同F(xiàn)c/2變體的相對量中顯示出可重復(fù)的結(jié)果。這就是為什么Fc/2和GLP-1肽都被檢測為幾種變體。云南GingisREXIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

Genovis的IdeS蛋白酶是IgG特異性半胱氨酸蛋白酶。青海FabRICATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

為了讓所有實驗室都能同時快速自動消化多種抗體，Genovis的FabRICATORMagIC的設(shè)計具有靈活性，適用于一系列自動化平臺。我們在ThermoScientific?KingFisher?純化系統(tǒng)上優(yōu)化了FabRICATORMagIC的工作流程，但它可以轉(zhuǎn)移到其他自動化平臺，如果沒有自動化，在振動臺上也能同樣出色地工作。消解后，將含有處理樣品的深孔板直接轉(zhuǎn)移到LC-MS的自動進(jìn)樣器中進(jìn)行快速色譜分析，或轉(zhuǎn)移到其他分析方法進(jìn)行分析。FabRICATORMagIC與在消解緩沖液中添加0.05%聚山梨醇酯20兼容，以極大限度地減少自動化系統(tǒng)中可能發(fā)生的純粹壓力。使用KingFisher儀器處理樣品時，樣品制備非常簡單。將樣品、樹脂和緩沖液移液到指定的孔或板中，然后將板放入儀器中。設(shè)計用于FabRICATORMagIC的BindIt?協(xié)議將控制每個步驟的孵育溫度和時間。青海FabRICATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)